Поскольку вариант Дельта наносит серьезный ущерб невакцинированному населению, а число случаев COVID-19 растет по всему миру, пандемия еще далека от завершения. Несмотря на впечатляюще быстрое развитие диагностических тестов SARS-CoV-2 за последние полтора года, подавляющее большинство образцов пациентов по-прежнему необходимо отправлять в лабораторию для обработки, что замедляет темпы отслеживания случаев COVID-19. Если образец должен быть протестирован на конкретный вариант вируса, он должен быть генетически секвенирован, что требует еще больше времени и ресурсов.
Теперь исследователи из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, Массачусетского технологического института (MIT) и нескольких больниц в районе Бостона создали недорогой диагностический тест на основе CRISPR, который позволяет пользователям проверять себя на SARS-CoV. -2 и несколько вариантов вируса с использованием образца их слюны дома без дополнительных инструментов.
Диагностическое устройство, называемое SHERLOCK с минимальным набором инструментов (miSHERLOCK), простое в использовании и обеспечивает результаты, которые можно прочитать и проверить с помощью прилагаемого приложения для смартфона в течение одного часа. Он успешно различает три различных варианта SARS-CoV-2 в экспериментах и может быть быстро перенастроен для обнаружения дополнительных вариантов, таких как Delta. Устройство можно собрать с помощью 3D-принтера и общедоступных компонентов примерно за 15 долларов, а повторное использование оборудования снижает стоимость отдельных анализов до 6 долларов каждый.
«miSHERLOCK устраняет необходимость в транспортировке образцов пациентов в централизованное место тестирования и значительно упрощает этапы подготовки образцов, предоставляя пациентам и врачам более быструю и точную картину здоровья человека и общества, что имеет решающее значение во время развивающейся пандемии», - сказал соавтор. первый автор Хелена де Пуч, доктор философии, научный сотрудник Института Висс и Массачусетского технологического института.
Диагностическое устройство описано в статье, опубликованной сегодня в журнале Science Advances .
От цепочки поставок до SHERLOCK
Будучи инструктором по педиатрии в Бостонской детской больнице со специализацией в области инфекционных заболеваний, соавтор Роуз Ли, доктор медицинских наук, более года работала на переднем крае пандемии COVID-19. Ее опыт работы в клинике послужил источником вдохновения для проекта, который в конечном итоге стал miSHERLOCK.
«Простые вещи, которые раньше были повсеместными в больнице, такие как мазки из носоглотки, внезапно стало трудно достать, поэтому рутинные процедуры обработки образцов были нарушены, что является большой проблемой в условиях пандемии», - сказал Ли, который также является приглашенным научным сотрудником в Институте Висса. «Мотивация нашей команды для этого проекта заключалась в том, чтобы устранить эти узкие места и обеспечить точную диагностику COVID-19 с меньшей зависимостью от глобальных цепочек поставок, а также смогла точно обнаружить варианты, которые начали появляться».
Процедура диагностики требует только, чтобы пользователь плюнул в камеру для подготовки проб, а затем перенес сборный диск в реакционную камеру и нажал на поршень, который активирует реакцию и сводит к минимуму риск перекрестного загрязнения. Предоставлено: Институт Висса при Гарвардском университете.
Для обнаружения SARS-CoV-2 в своей диагностике группа обратилась к технологии на основе CRISPR, созданной в лаборатории члена факультета Wyss Core и старшего автора статьи Джима Коллинза, доктора философии. называется «специфическая высокочувствительная разблокировка ферментативного репортера» (SHERLOCK). SHERLOCK использует «молекулярные ножницы» CRISPR, чтобы вырезать ДНК или РНК в определенных местах, с дополнительным бонусом: этот конкретный тип ножниц также разрезает другие части ДНК в окружающей области, позволяя создавать молекулы зондов нуклеиновых кислот для генерировать сигнал, указывающий, что цель была успешно поражена.
Исследователи создали реакцию SHERLOCK, предназначенную для разрезания РНК SARS-CoV-2 в определенной области гена, называемого нуклеопротеином, который сохраняется во многих вариантах вируса. Когда молекулярные ножницы - фермент под названием Cas12a - успешно связывается и разрезает ген нуклеопротеина, зонды одноцепочечной ДНК также разрезаются, производя флуоресцентный сигнал. Они также создали дополнительные тесты SHERLOCK, предназначенные для нацеливания на панель вирусных мутаций в последовательностях белка Spike, которые представляют три генетических варианта SARS-CoV-2: альфа, бета и гамма.
Вооружившись тестами, которые могут надежно обнаружить вирусную РНК в пределах допустимого диапазона концентраций для диагностических тестов, разрешенных FDA, команда затем сосредоточила свои усилия на решении, пожалуй, самой сложной проблемы в диагностике: приготовлении образцов.
Плевать, ждать, сканировать
«Когда вы тестируете образец на нуклеиновые кислоты [например, ДНК или РНК], вам необходимо выполнить множество шагов, чтобы подготовить образец, чтобы вы могли действительно извлечь и амплифицировать эти нуклеиновые кислоты. он доставляется в испытательный центр, а также убедитесь, что он не заразен, если вы имеете дело с трансмиссивным заболеванием. Чтобы сделать этот диагностический тест действительно простым в использовании , нам было важно максимально упростить его. насколько это возможно », - сказал соавтор исследования Сяо Тан, доктор медицинских наук, научный сотрудник Института Висс и инструктор по гастроэнтерологии в больнице общего профиля Массачусетса.
Команда решила использовать в качестве метода сбора образцы слюны, а не мазков из носоглотки, потому что пользователям проще собирать слюну, а исследования показали, что SARS-CoV-2 обнаруживается в слюне в течение большего количества дней после заражения. Но необработанная слюна сама по себе создает проблемы: она содержит ферменты, которые расщепляют различные молекулы, что приводит к высокому уровню ложных срабатываний.
Исследователи разработали новую технику для решения этой проблемы. Во-первых, они добавили в слюну два химиката, называемые DTT и EGTA, и нагрели образец до 95 ° C в течение 3 минут, что устранило ложноположительный сигнал от необработанной слюны и вскрыло все вирусные частицы. Затем они включили пористую мембрану, которая была сконструирована для улавливания РНК на своей поверхности, которую, наконец, можно было добавить непосредственно в реакцию SHERLOCK для получения результата.
Чтобы объединить подготовку образца слюны и реакцию SHERLOCK в одну диагностику, команда разработала простое устройство с батарейным питанием с двумя камерами: камера для подготовки образцов с подогревом и камера для реакции без подогрева. Пользователь плюется в камеру для пробоподготовки, включает нагрев и ждет от трех до шести минут, пока слюна не попадет в фильтр. Пользователь снимает фильтр и переносит его в колонну реакционной камеры, затем толкает поршень, который помещает фильтр в камеру, и прокалывает резервуар для воды, чтобы активировать реакцию ШЕРЛОКА. Спустя 55 минут пользователь смотрит через тонированное окно трансиллюминатора в реакционную камеру и подтверждает наличие флуоресцентного сигнала. Они также могут использовать сопутствующее приложение для смартфонов, которое анализирует пиксели, регистрируемые смартфоном.
Прилагаемое приложение для смартфона анализирует флуоресцентные данные, полученные в результате анализа, давая пользователям четкий «положительный» или «отрицательный» результат. Результаты также могут быть переданы врачам и организациям здравоохранения для отслеживания распространения болезни. Предоставлено: Институт Висса при Гарвардском университете.
Исследователи протестировали свое диагностическое устройство, используя клинические образцы слюны 27 пациентов с COVID-19 и 21 здорового пациента, и обнаружили, что miSHERLOCK правильно идентифицировал пациентов с COVID-19 в 96% случаев и пациентов без заболевания в 95% случаев. Они также проверили его эффективность против вариантов Alpha, Beta и Gamma SARS-CoV-2, добавив в здоровую человеческую слюну полноразмерную синтетическую вирусную РНК, содержащую мутации, представляющие каждый вариант, и обнаружили, что устройство было эффективным в отношении ряда вирусных РНК. концентрации.
«Одна из замечательных особенностей miSHERLOCK заключается в том, что он полностью модульный. Само устройство отделено от анализов, поэтому вы можете подключать различные анализы для конкретной последовательности РНК или ДНК, которую вы пытаетесь обнаружить», - сказал один из первых. автор Девора Наджар , научный сотрудник MIT Media Lab и Collins Lab. «Устройство стоит около 15 долларов, но массовое производство снизит стоимость корпуса примерно до 3 долларов. Анализы для новых целей могут быть созданы примерно за две недели, что позволит быстро разработать тесты на новые варианты COVID-19 и других заболеваний».
Готовы к реальному миру
Команда miSHERLOCK создала свое устройство с учетом ограниченных ресурсов, поскольку пандемия выявила огромное неравенство в доступе к здравоохранению, которое существует между различными частями мира. Аппаратное обеспечение устройства может быть создано любым, у кого есть доступ к 3D-принтеру, а файлы и схемы схем общедоступны в Интернете. Добавление приложения для смартфона также было направлено на ограниченные ресурсы, поскольку услуги мобильной связи доступны практически в любой точке мира, даже в районах, до которых трудно добраться пешком. Команда готова работать с производителями, которые заинтересованы в масштабном производстве miSHERLOCK для глобального распространения.
«Когда начался проект miSHERLOCK, мониторинг вариантов SARS-CoV-2 практически не проводился. Мы знали, что отслеживание вариантов будет невероятно важным при оценке долгосрочного воздействия COVID-19 на местные и глобальные сообщества, поэтому мы подтолкнули себя к созданию действительно децентрализованной, гибкой и удобной диагностической платформы », - сказал Коллинз, который также является профессором медицинской инженерии и науки в Массачусетском технологическом институте. «Решив проблему подготовки образцов , мы обеспечили, что это устройство практически готово к использованию потребителями как есть, и мы рады работать с промышленными партнерами, чтобы сделать его коммерчески доступным».
«Объединив передовые биотехнологии с недорогими материалами, эта команда создала мощное диагностическое устройство, которое может быть произведено и использовано на местном уровне людьми без высшего медицинского образования. Это прекрасный пример миссии Института Висса в действии: передать изменяющие жизнь инновации в руки людей, которые в них нуждаются ", - сказал директор-основатель Wyss Дон Ингбер, доктор медицины, доктор философии, который также является профессором биологии сосудов Гарвардской медицинской школы и Бостонской детской больницы Джуды Фолкмана, и Профессор биоинженерии Гарвардской школы инженерии и прикладных наук Джона А. Полсона.
